Метод розеткообразования иммунология

Иммунологическая диагностика. Иммунологические синдромы

Метод розеткообразования иммунология

Иммунный статус – это совокупность количественных и функциональных показателей, отражающих состояние иммунной системы человека в данный момент времени.

Первым этапом специфической иммунологической диагностики является иммунологический анамнез.

Это очень важная часть общего анамнеза больного, независимо от основного заболевания, позволяет выяснить наличие заболеваний в прошлом, установить или заподозрить иммунологическую причину заболевания или направление поиска иммунологических нарушений.

В результате сбора анамнеза следует сразу выяснить тип вероятного иммунопатологического синдрома. Существуют различные точки зрения на количество и проявления иммунопатологических синдромов.

На современном этапе, на наш взгляд, следует выделять 6 иммунопатологических синдромов. Эта точка зрения освещена также и Е.И.Соколовим (1998).

Иммунологические синдромы

Иммунологические синдромыИтак, выделяется 6 иммунопатологических синдромов:1. Инфекционный синдром.2. Аллергический синдром.3. Аутоиммунный синдром.4. Первичный иммунодефицит.5. Вторичный иммунодефицит.

6.Имунопролиферативний синдром.

Инфекционный синдром

Инфекционный синдром – для него наиболее характерны:1. длительный субфебрилитет, лихорадка нечеткой этиологии;2. хронические инфекции ЛОР– органов (синуситы, отиты), лимфадениты;3. хронические заболевания дыхательных путей, которые часто повторяются;4.

высокая частота острых респираторных вирусных заболеваний (у взрослых более чем 4 раза, у детей – более 6 раз в год);5. бактериальные поражения кожи и подкожной клетчатки (пиодермии, фурункулез, абсцессы, флегмоны, рецидивирующие парапроктиты у взрослых);6. грибковые поражения кожи, слизистых оболочек и ногтей;7.

паразитарные инфекции;8. афтозные стоматиты, заболевания пародонта, кариес;9. рецидивирующие гнойные конъюнктивиты;10. рецидивирующий герпес различной локализации;11. повторные лимфадениты;12. хронические урогенитальные инфекции (хронический гнойный вульвит, уретрит, рецидивирующий цистит и пиелонефрит);13.

[attention type=yellow]

дисбактериоз кишечника, хроническая гастроэнтеропатия с диареей неизвестного генеза;

[/attention]

14. генерализованные инфекции.

Аллергический синдром

Наиболее характерными его проявлениями являются:1. аллергические заболевания кожи (атопiчний и контактный дерматит, крапивница, отек Квинке, феномен Артюса, экзема);2. аллергические заболевания ЛОР – органов (полiноз, хронический аллергический ринит и риносусит);3. бронхиальная астма;4. признаки пищевой аллергии (непереносимость пищевых продуктов);5. признаки лекарственной аллергии;

6. признаки непереносимости химических соединений.

Аутоиммунный синдром

1. воспалительные заболевания опорно – двигательного аппарата (ревматоидный артрит);2. системная красная волчанка, дерматомиозит, склеродермия;3. системные васкулиты (гранулематоз Вегенера, узловатый периартериит и др.);4. гломерулонефриты;5.

патология щитовидной железы, инсулинозависимый сахарный диабет, болезнь Аддисона, синдром Шегрена и другие гормональные нарушения);6. неврологические заболевания (рассеянный склероз, миастения Гравис и др..)7. неспецифический язвенный колит;8. аутоиммунные заболевания печени;9.

аутоиммунные формы бесплодия, патология беременности, тяжелые формы течения климактерического синдрома;

10. некоторые виды психопатологии (шизофрения).

Первичные иммунодефициты (преимущественно у детей)

1. Синдром Луи – Бар – атаксия в сочетании с телеангиэктазии, пятнами гипер – и депигментации;2. Синдром Вискота – Олдрича – геморрагический симптомокомплекс в сочетании с экземой и тромбоцитопенией у мальчиков;3. синдром Ди–Джорджи – судорожный синдром с гипокальциемией, пороками развития лицевого скелета и сердечно – сосудистой системы, гипоплазией тимуса;

4. наследственные ангионевротический отек различной локализации (недостаточность ингибитора С1 компонента комплемента).

Вторичные иммунодефициты

1. все виды инфекционного синдрома в случае длительного торпидного к терапии лечения, тенденции к генерализации процесса;2. алопеция, де– и гиперпигментация кожи;3. СПИД;

4.другие случаи приобретенной иммунной недостаточности.

Лимфопролиферативный синдром

1. опухоли в иммунной системе (лимфолейкозы, лимфосаркомы, болезнь Ходжкина, лимфомы, саркома Капоши);2. Х – сжатых рецессивный лимфопролиферативный синдром у детей;3. гиперплазия всех групп лимфатических узлов с воспалительными процессами в них в сочетании с частыми бактериальными инфекциями другой локализации;4. спленомегалия;

5. мононуклеоз в анамнезе.

Таким образом, после опроса больного, мы можем заподозрить вероятный иммунологический синдром и направить больного для дальнейшего лабораторного исследования с определенным перечнем иммунологических тестов.

Диагностика иммунных нарушений

Сейчас для диагностики иммунных нарушений используется большое количество различных тестов, которые проводятся по разным методикам, и в зависимости от этого по разному интерпретируются. Р.В.

Петров предложил комплекс унифицированных тестов, которые распределены на тесты 1 уровня (ориентировочные) и тесты 2 уровня (уточняющие).

Их использование и интерпретация достаточные (в совокупности с предварительной информации, полученной при клинико – анамнестических обследовании) для установки основной массы иммунологических диагнозов.

К тестам 1 уровня относят:1. Определение общего количества лейкоцитов (абсолютного и относительного количества), по данным лейкограммы.2. Определение абсолютного и относительного количества Т – и В– лимфоцитов.3. Определение концентрации основных классов сывороточных иммуноглобулинов (Ig A, Ig M, Ig G).4. Определение фагоцитарной активности лейкоцитов.

5. Определение титра комплемента.

После анализа результатов тестов 1 уровня врач может сделать вывод, нужно ли дальнейшее обследование больного. Тесты 1 уровня дают возможность подтвердить или опровергнуть предположение о нарушении функционирования иммунной системы.

При необходимости проводят тесты 2 уровня (аналитические). На третьем этапе идентифицируют поражения той или звенья иммунной системы.

Аналитические тесты рекомендуется применять для углубленного анализа состояния иммунной системы, определения уровня и глубины нарушений в иммунной системе.

Тесты 2 уровня включают:1. Определение основных регуляторных субпопуляций Т – лимфоцитов.2. Тест ингибиции миграции лимфоцитов (ИМЛ).3. Оценка пролиферативной активности Т – и В– лимфоцитов на митогены. Антигены, аллогенные клетки (РБТЛ).4. Определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК).5. Определение различных компонентов комплемента.

6. Определение естественных антител (гетерофильных агглютининов).

[attention type=red]

Тесты третьего уровня включают:1. Тесты, которые проявляют медиаторы иммунной системы, в том числе и продукцию интерлейкинов.2. Определение общего и специфического IgE.3.Определение уровня кислородно –зависимого метаболизма фагоцитирующих клеток (НСТ– тест).4. Определение антигенспецифичних антител.

[/attention]

5. Определение активности ферментов (аденозиндезаминазы, пуриннуклеозидфосфарилазы).

II. Другие тесты, характеризующие состояние иммунной системы
Особой сложностью является интерпретация иммунограммы. На наш взгляд, иммунограмму должен уметь растолковать врач общей практики. Он должен опираться на данные анамнеза, объективного исследования.

А проводить интерпретацию только иммунограммы, без учета других сведений о пациенте, неправомерно, ибо отклонения на иммунограмма для многих патологических процессов однотипные, зависят от фазы заболевания, генетических и многих других особенностей, и учесть абсолютно все это может только врач– клиницист.

Методы определения лимфоцитов

1. Абсолютное содержание лимфоцитов в периферической крови
Вычеты абсолютного содержания лимфоцитов в периферической крови проводится после определения обычного процентного содержания белой крови и общего числа лейкоцитов.

У практически здоровых лиц абсолютное содержание лимфоцитов составляет 1,7 – 2,0 г / л, что рассматривается как нормальный уровень показателя.

Примерное (1,7 – 1,5 г / л) и значительное (1,5 г / л и менее) является основой для углубленного изучения иммунного статуса.

2. Определение количества Т – лимфоцитовВ настоящее время для идентификации поверхностных структур лимфоцитов и ряда других клеток обычно используют 3 группы методов: а) розеткообразования; б) методы иммунофлюоресценции; в) иммуноферментные методы.

Дешевым и одновременно достаточно точным методом является метод определения численности популяции Т – лимфоцитов с помощью розеткообразования (Е –РОК).

Метод основан на том, что Т –клетки несут на своей поверхности рецепторы к чужеродным эритроцитов, благодаря чему функционально активные лимфоциты человека способны адсорбировать эритроциты барана с образованием «розетки ».

Розеткой считается фигура, которая состоит из лимфоцита и с 3 и более присоединенных к нему эритроцитов.

Прогрессивными считаются иммунофлюоресцентные и иммуноферментные методы, позволяющие с помощью наборов моноклональных антител к различным CD антигенов идентифицировать практически любые поверхностные структуры лимфоцитов.

На поверхности Т – лимфоцитов находятся антигены CD3 +. После выяснения относительного количества Т – лимфоцитов с помощью несложных расчетов определяется абсолютное содержание этих клеток.

В среднем он составляет 0,7 – 0,9 г / л.

Повышение абсолютного и относительного количества Т – лимфоцитов отмечается при лимфопролиферативных заболеваниях, в период рековалесценции и у больных туберкулезом (может быть на начальных стадиях заболевания).

Уменьшение количества Т – лимфоцитов наблюдается при бактеральних и вирусных острых и хронических инфекциях, иммунодефицитах, опухолях, туберкулезе, травматических поражениях, ожогах, стрессе, кровоизлияниях, инфаркте.

3.

[attention type=green]

Определение субпопуляционного состав Т – лимфоцитовОпределение количества Т – лимфоцитов, которые выполняют хелперную и супрессорную функции, происходит в реакции спонтанного розеткообразования с добавлением в реакцию теофиллина, и основывается на том, что рецепторы к чужеродным эритроцитов на клетках, которые выполняют супрессорную функцию, чувствительны к теофиллина и блокируются ним, при добавлении в реакцию. Таким образом мы обнаруживаем теофилинчутливих розеткоутворювальни клетки (Е ТФЧ – РУК), которые выполняют супрессорную функцию, и теофилинрезистентних (Е ТФР – РУК), которые выполняют хелперную функцию.С помощью моноклональных антител мы можем точнее выяснить субпопуляционный состав. Так, Т – лимфоциты, которые выполняют хелперную функцию, имеют на поверхности антигены CD4 +, а Т – лимфоциты, которые выполняют супрессорную функцию – антигены CD8 +.

[/attention]

Очень важно нормальное соотношение Т – лимфоцитов, которые выполняют хелперную и супрессорные функции. При применении различных методик исследования это соотношение остается постоянным и называется иммунорегуляторного индекса (ИРИ) и равен 1,7 – 2,5.

Снижение этого индекса происходит при:1. СКВ с поражением почек;2. острой цитомегаловирусной инфекции;3. СПИДе;4. герпетической инфекции;5. инфекциии, вызванной вирусом Эпштейна – Барр (инфекционном мононуклеозе);6. инсоляции, или длительном облучении ультрафиолетовыми лучами;7. у новорожденных;

8. пересадке костного мозга.

Повышение индекса отмечается при:1. ревматоидном артрите;2. сахарном диабете 1 типа;3. СКВ без поражения почек;4. первичном билиарном циррозе;5. атопическом дерматите;6. поллинозе;7. атопической бронхиальной астме;8. псориазе;

9. хроническом аутоиммунном гепатите.

4. Определение функциональной активности Т – лимфоцитов происходит посредством реакции бластной трансформации с фитогемагглютинином (ФГА) или лимфоцитарным митогеном (ПМ). Она основывается на том, что специфические митогены вызывают пролиферацию и трансформацию.

Людмила ОСИПОВА 
доцент кафедры клинической иммунологии и аллергологии НМАПО им. П.Л.Шупика

Источник: http://family-doctor.com.ua/zdorove-ot-a-do-ya/immunologiya/immunologicheskaya-diagnostika-immunologicheskie-sindromy/

Розеткообразования тесты

Метод розеткообразования иммунология

Розеткообразования тесты — лабораторные методы идентификации и количественного определения T- или B-лимфоцитов, субпопуляций этих лимфоцитов и нек-рых других клеток, основанные на их способности фиксировать на своей поверхности эритроциты.

Розеткообразующим лимфоцитом, или розеткообразующей клеткой (РОК), называют лимфоцит (гранулоцит, макрофаг и др.), к-рый фиксирует три и более эритроцитов (см. Иммунное прилипание).

Расположение эритроцитов на поверхности РОК может быть различным: в одних случаях они образуют венчик, в других — неполный венчик, иногда РОК полностью окружена эритроцитами — такая розетка получила название «морула» (рис.). Иногда эритроциты располагаются в несколько слоев.

В тех случаях, когда к РОК присоединено более 36 эритроцитов, розетки называют гигантскими. Феномен розеткообразования чаще всего используется для изучения поверхностных рецепторов на мембране лимфоцитов (см.).

Микропрепараты розеткообразующих лимфоцитов: а — лимфоцит с фиксированными на его поверхности тремя эритроцитами; б — лимфоцит с фиксированными на его поверхности эритроцитами, образующими венчик; в — лимфоцит, полностью окруженный эритроцитами, образующими так называемую морулу; 1 — лимфоцит; 2 — эритроциты.

Р. т. были введены в практику иммунол. и иммунохим. лабораторий в конце 60-х — начале 70-х гг. 20 в. для оценки иммунной реакции экспериментальных животных на иммунизацию ксеногенными эритроцитами. Затем Р. т. были применены для исследования лимфоцитов крови человека.

В зависимости от способа постановки Р. т. их делят на две группы: тесты спонтанного розеткообразо-вания и тесты непрямого розеткооб-разования. Ниже они рассматриваются на примере лимфоцитарного розеткообразования.

Тесты спонтанного розеткообразования

Спонтанное розеткообразование происходит при присоединении к поверхности лимфоцитов крови человека гетерологичных эритроцитов, чаще всего эритроцитов барана или мыши. Т-лимфоциты имеют на своей поверхности рецепторы для эритроцитов барана (см. Иммунокомпетентные клетки).

Образующиеся розетки получили название E-POR. Этот вид розеток наиболее исследован. В-лимфоциты имеют на своей поверхности рецепторы, специфичные для эритроцитов мышей. Образующиеся розетки обозначают Ем-РОК. Этот тест менее изучен и меньше применяется в лаб.

практике, чем тест на образование Е-РОК.

Тест на образование Е-РОК. Этим способом определяют общую популяцию Т-лимфоцитов. Методика постановки теста заключается в следующем: смешивают взвесь лимфоцитов с 30—100-кратным количеством эритроцитов; смесь инкубируют при 37° в течение 5 мин.

, затем центрифугируют и выдерживают при 4°; осторожно встряхивают и подсчитывают в камере Горяева процент лимфоцитов, образующих розетки; при этом розетки можно фиксировать глутаральдегидом, делать на стекле мазки, окрашивать их и подсчитывать относительное содержание Е-РОК.

Одновременно подсчитывают абсолютное количество Е-РОК в единице объема исследуемого образца крови.

[attention type=yellow]

По данным многих исследователей, Е-РОК могут образовывать до 70% всех лимфоцитов крови человека.

[/attention]

Отмечено снижение числа Е-РОК при ряде аллергических, аутоаллергических и инфекционно-аллергических заболеваний, что свидетельствует об угнетении механизма клеточного иммунитета (см.).

Однако число Е-РОК не всегда адекватно состоянию клеточного иммунитета, поэтому требуются дополнительные методы исследования.

Небольшие изменения в методике постановки Р. т. позволяют определить не всю, а только часть популяции Т-лимфоцитов. По характеру образования Е-РОК различают следующие виды субпопуляций Т-лимфоцитов.

Субпопуляция Т-лимфоцитов с высокой связывающей активностью по отношению к эритроцитам барана образует так наз. активные Е-РОК. Эта популяция составляет ок. 22— 32% всех Т-лимфоцитов pi больше коррелирует с выраженностью клеточного иммунитета, чем общее количество Т-клеток, присоединяющих к своей поверхности эритроциты барана.

Установлено, что такая субпопуляция Т-лимфоцитов не имеет на своей поверхности Fc-рецептора для IgG ит. о., очевидно, не обладает супрессорной активностью. Для выявления субпопуляции Т-лимфоцитов, образующих активные Е-РОК, на пробу берут меньшее количество эритроцитов и после центрифугирования пробу не выдерживают на холоде.

Если после центрифугирования взвесь инкубируют в течение 30 мин. при 37°, то происходит распад розеток. Обычно их остается до 3%. При активации Т-лимфоцитов при активном гепатите эта цифра увеличивается, при лечении глюкокор-тикоидными гормонами— снижается. Считают, что способность образовывать стабильные розетки более характерна для менее дифференцированных Т-лимфоцитов.

Т-лимфоциты здоровых людей образуют незначительное количество гигантских розеток. Их число увеличивается при постановке Р. т. с лимфоцитами, культивируемыми in vitro и стимулированными фитогемагглютинином.

[attention type=red]

Если заменить эритроциты барана ауто- или аллогенными эритроцитами человека, то выявляется способность Т-лимфоцитов образовывать розетки и с такими эритроцитами.

[/attention]

Считают, что этой способностью обладает особая субпопуляция Т-лимфоцитов. Количество этих розеток зависит от методики постановки Р. т.

Отмечено изменение их числа по сравнению с нормой при нек-рых опухолях и аутоаллергических заболеваниях.

Тест на образование Ем-РОК. Общий принцип постановки этого теста такой же, как и при постановке теста с Е-РОК, различие состоит лишь в том, что используются эритроциты мыши. Отмечено снижение или полное отсутствие образования розеток при агаммаглобулинемии и увеличение их образования при хрон. лимфолейкозе. У здоровых людей выявляется в среднем до 17% Ем-РОК.

Тесты непрямого розеткообразования

С помощью этих тестов на поверхности лимфоцитов человека выявляют различные рецепторы, не специфичные по отношению к эритроцитам. Поэтому к эритроцитам присоединяют так наз.

вставочные компоненты, к-рые могут соединяться с тем или иным рецептором на поверхности лимфоцита. Эритроциты в этих случаях фиксируются на лимфоците через этот вставочный компонент. Поэтому такие Р. т.

назвали тестами непрямого розеткообразо-вания. Различают следующие виды непрямого розеткообразования.

Тест на образование Fc-розеток (ЕА-розеток). На поверхности лимфоцитов, гранул оцитов, макрофагов и нек-рых других клеток человека имеются рецепторы, специфичные для Fc-фрагмента разных классов иммуноглобулинов (см.).

На поверхности как В-лимфоцитов, так и Т-лимфоцитов они выявлены для IgG, IgM, IgA и IgE, причем различные субпопуляции Т- или В-лимфоцитов имеют Fc-рецепторы только для определенных иммуногобулинов. Есть данные, что Т-лимфоциты с Fc-рецептором для IgM — Tji-клетки могут выполнять функцию Т-хелперов (англ.

helper помощник), способствуя пролиферации и дифференциации В-лимфоцитов в плазматические клетки (см.), а Т-лимфоциты с Fc-рецептором для IgG—Ту-клетки могут быть Т-супрессорами, тормозящими образование антител (см.) против собственных антигенов (см.).

Для выявления клеток, несущих Fc-рецеитор, эритроциты крупного рогатого скота сенсибилизируют кроличьими антиэритроцитарными IgG- или IgM—антителами. Комплекс эритроцит — антитело, к-рый обычно обозначают EA (Е — эритроцит, А — антитело), добавляют к лимфоцитам и инкубируют. Живые лимфоциты образуют Fc-розетки (ЕА-розетки).

У здоровых людей по данным разных исследователей, образование ЕА-розеток значительно варьирует, что объясняется отсутствием стандартного теста. При нек-рых патологиях, напр, при хрон. лимфолейкозе (см. Лейкозы), выявляются значительные отклонения в образовании ЕА-розеток по сравнению со среднестатистическими данными по норме.

Тест на образование комплементарных розеток (EАС-розеток). Лимфоциты людей имеют на своей поверхности два типа рецепторов к комплементу (С): иммуносвязывающие рецепторы — СЗЬ (фрагмент третьего компонента С) и С3с1-рецепторы (фрагмент рецептора СЗЬ), обладающие специфичностью к разным частям молекул СЗ и С4.

Чаще всего оба рецептора присутствуют на лимфоцитах, имеющих рецептор, специфичный для С. Общим принципом определения этого вида лимфоцитов является сенсибилизация эритроцитов барана кроличьими антиэритро-цитарными IgM-антителами и добавление комплемента человека.

[attention type=green]

Образовавшийся комплекс ЕАС (Е — эритроциты, А — антитела, С — комплемент) соединяют со взвесью лимфоцитов. Сенсибилизированные эритроциты фиксируются на лимфоцитах через комплемент. Образуются розетки, к-рые получили название «ЕAC-розетки».

[/attention]

Существуют различные модификации этого теста с использованием эритроцитов других видов животных и человека, а также комплемента (см.) (напр., комплемента мыши), что позволяет выявлять тот или иной комплементарный рецептор.

Считают, что ЕАС-клетки являются скорее всего В-лимфоцита-ми, однако рецептор, специфичный для СЗ, имеется также на Т-лимфоцитах, «ноль-клетках» и моноцитах. Определяемое методом ЕАС-розеток количество лимфоцитов в крови человека зависит от методики и колеблется от 15% до 25%.

Тест на образование антигенсвязывающих розеток. С помощью этого теста выявляют сенсибилизированные лимфоциты, связывающие антигены собственных тканей. Розетки вокруг сенсибилизированных лимфоцитов образуются эритроцитами человека, нагруженными теми или иными тканевыми антигенами. При нек-рых коллагенозах (см. Коллагеновые болезни) установлено увеличение количества таких розеток.

Тест на образование гистаминовых розеток. Ок. 30% В-лимфоцитов и 10% Т-лимфоцитов крови человека имеют на своей поверхности специфичный в отношении гистамина рецептор. Он выявляется на дифференцированных Т- и В-клетках.

В популяции Т-лимфоцитов этот рецептор может служить маркером зрелых клеток, обладающих супрессорной или цитотоксической активностью. Для выявления лимфоцитов, несущих гистаминовый рецептор, на эритроцитах фиксируют гистамин, а затем эти эритроциты смешивают с лимфоцитами.

Образуются розетки, в к-рых эритроциты фиксируются на поверхности лимфоцита с помощью гистамина.

Тест на образование аденозиновых розеток. Ок. 11% лимфоцитов крови человека содержат рецепторы, специфичные для аденозина.

[attention type=yellow]

Для их выявления на эритроцитах крупного рогатого скота фиксируют комплекс аденозин — сывороточный альбумин человека и смешивают его с лимфоцитами.

[/attention]

За счет связывания аденозина с соответствующими рецепторами на поверхности лимфоцитов образуются розетки. Эта группа лимфоцитов относится гл. обр. к Т-лимфоцитам.

Библиография: Лимфоциты, выделение, фракционирование и характеристика, под ред. Дж. Б. Натвига и др., пер. с англ., М., 1980; Патогенез аллергических процессов в эксперименте и клинике, под ред. А. М. Чернуха и В. И. Пыцкого, с. 285, М., 1979; Петров Р. В., Борисова А. М. и Абаскулиева Э. К.

Использование метода розеткообразования для оценки Т- и В-систем иммунитета у больных ревматизмом, Тер. арх., т. 50, № 12, с. 99, 1978, библиогр.; Петров Р. В., Стенина М. А. и Лебедев К. А. Особенности оценки количества Т-лимфоцитов и других розеткообразующих клеток в крови здоровых и больных людей, Бюлл. эксперим. биол. и мед., т.

81, №2, с. 197, 1976, библиогр.; Dolen J. G. a. Park В. Н. An improved micro-method for enumeration of human В-cell rosettes with mouse red blood cells, Immunol. Commun., v. 7, p. 677, 1978; Harada М. a. Mattori K. Heterogeneity of human peripheral T lymphocytes, Allerg. Immunopathol., v. 6, p. 65, 1978, bibliogr.; Morоz Ch. a. o.

Human adenosine receptor bearing lymphocytes, enumeration, characterization, and distribution in peripheral blood lymphocytes, Clin. Immunol, a. Immunopathol., v. 18, p. 47, 1981, bibliogr.; Saxon A.,Morledge V. D. a. Bonavida B. Histamine-receptor leucocytes (HRL), Organ and lymphoid subpopulation distribution in man, Clin, exp.

Immunol., v. 28, p. 394, 1977.

М. В. Егорова.

Источник: https://xn--90aw5c.xn--c1avg/index.php/%D0%A0%D0%9E%D0%97%D0%95%D0%A2%D0%9A%D0%9E%D0%9E%D0%91%D0%A0%D0%90%D0%97%D0%9E%D0%92%D0%90%D0%9D%D0%98%D0%AF_%D0%A2%D0%95%D0%A1%D0%A2%D0%AB

Современные методы исследования в иммунологии

Метод розеткообразования иммунология

В течение миллионов лет иммунная система создавала различные инструменты для борьбы с патогенами.

Результатом стала чрезвычайно сложная система защиты организма от инфекций и других чужеродных агентов (мутировавших клеток, инородных предметов и веществ).

Современные методы исследования в иммунологии позволяют глубже изучить эту систему, диагностировать различные заболевания на ранней стадии. 

Что относят к иммунологическим методам исследования? 

Основой практически всех иммунологических методов исследования являются специфические реакции антиген/антитело. Антитела – один из основных белков иммунной системы, их функции: 

  • Распознание чужеродных молекул; 
  • Их маркировка; 
  • Нейтрализация вирусов. 

Именно способность антител избирательно соединяться с чужеродными молекулами (антигенами) позволила создать современные высокоточные методы диагностики в иммунологии.

Метод ИФА

Иммуноферментный анализ используется для обнаружения в растворе определенного белка, дает информацию об его количестве. Метод пришел на смену устаревшему радиоиммунному анализу, в котором использовались меченные радиоактивными изотопами антитела. 

Благодаря относительной простоте, высокой чувствительности и специфичности ИФА лежит в основе большинства экспресс-тестов к возбудителям различных инфекций. Также он широко применяется в аллергологии для определения веществ, на которые реагирует иммунная система. 

 

«Классическая» методика

В настоящее время наиболее распространен твердофазный ИФА, это один из самых популярных лабораторных методов исследования в иммунологии. Для его проведения используют специальные планшетки с лунками, заполненными адгезивным пластиком. В нем заранее осаждают специфические антитела и особый фермент, которые при реакции антиген/антитело изменяет свой цвет. 

Для проведения анализа в лунку добавляют плазму крови либо другие анализируемые жидкости. Если реакция оказалась положительной субстрат изменит свой цвет, по степени окраски можно очень точно подсчитать количество прореагировавших антигенов. 

Модификации ИФА

Существует множество различных вариантов проведения этой реакции в зависимости от целей, стоящих перед исследователями. К самым распространенным относятся: 

  • Сэндвич-ИФА. Метод позволяет определять наличие даже очень небольшого количества антигенов. Для этого после добавления антигена в лунку, вносят еще некоторое количество антител, затем эту операцию повторяют нужное количество раз. Это позволяет создать послойную структуру антиген-антитело, несколько напоминающую сэндвич. 
  • Конкурирующий ИФА. Применяется для обнаружения в крови специфических антител. Для этого в лунки планшета вносят антиген, к которому добавляют плазму крови, смешанную с меченными антителами, специфичными для этого антигена. Чем больше антител из плазмы прореагирует с антигеном, тем слабее будет изменение цвета лунки, так как они не несут на себе фермента, изменяющего цвет в процессе реакции. 
  • Мультиплексная ИФА. Позволяет одновременно определить содержание в образце сотен разнородных белков. Был создан так как объекты и методы исследований в иммунологии требуют детального отслеживания концентрации большого количества компонентов, что сложно реализовать другими способами. В мультиплексной ИФА в одной лунке содержаться множество полимерных сфер микроскопических размеров, на поверхности которых размещены специфические антитела и ферменты (как в классической ИФА). Для изучения результатов реакции используют специальное оборудование, способное точно отследить изменения цвета разных микросфер 

Вестерн-блоттинг

Принципиально метод мало отличается от ИФА. При его использовании также происходит обнаружение реагирующих с определенными антителами белков. Существенных различий два: 

  • Осаждение антител происходит на нитроцеллюлозной мембране. На ней же и протекает реакция при добавлении исследуемого раствора; 
  • Для визуализации результата добавляют фермент, способный светиться при протекании реакции антиген/антитело. 

За счет использования «светящихся» ферментов вестерн-блоттинг позволяет получать серии снимков с различной экспозицией. Это полезно, если нужно отследить динамику протекания реакции в различных условиях. 

Важное преимущество вестерн-блоттинга – мембрану можно использовать повторно, достаточно «отмыть» вторичные антитела. 

Иммунохроматография (ИХА)

Современный метод исследования в иммунологии легший в основу огромного количества экспресс-тестов. ИХА используется в тестах на беременность, для быстрого обнаружения в крови наркотических веществ. 

Реакция протекает в тест-полоске, содержащей заранее внесенные антитела и ферменты-красители. При смачивании ее биологической жидкостью (кровь, слюна, моча и т. д.

) она начинает мигрировать вдоль нее, смешиваясь с антителами.

Если в исследуемом образце есть соответствующий белок – он свяжется с антителами и при достижении слоя, содержащего краситель – произойдет реакция и тест-полоска изменит свою окраску. 

[attention type=red]

Хотя ИХА достаточно чувствительный метод, он позволяет только судить о наличии определенного белка в образце о его концентрации они информацию не дает. С этим связано ограниченное применение в виде доступных экспресс-тестов. 

[/attention]

 

Иммуногистохимия

Объектом этого метода исследований в иммунологии являются специфические антигены в тканях либо непосредственно на поверхности клеток. Он получил широкое распространение в онкологии так как позволяет точно определить тип опухоли, стадию ее развития и вероятность наличия метастазов. 

Порядок проведения: 

  • Полученные при биопсии либо после операции ткани замораживают и покрывают парафином. Затем выполняется микротомирование – образец нарезается очень тонкими слоями (толщиной до 18 мкм); 
  • Полученный срез размещают на предметном стекле, блокируют неспецифичные антигены путем «забивки» – добавлением сывороточного альбумина; 
  • К образцу добавляют специфические антитела, помеченные флуоресцентным веществом; 
  • Срез изучают при помощи флуоресцентного микроскопа либо фотоэлемента. 

Для проведения различных научных исследований используют другой вариант этой методики – имумноцитохимию. При этом изучается наличие антигенов непосредственно внутри клетки. Исследователи получают возможность получить ценную информацию о процессах, протекающих в ней. 

Проточная цитометрия 

Это один из самых высокотехнологичных современных методов исследования в иммунологии. Позволяет провести точное иммунофенотипирование клеток, определить наличие определенных белков внутри клетки и на поверхности ее мембраны. В медицине используется для диагностики опухолей, точной оценки состояния иммунной системы и ее клеточного звена. 

Для проведения анализа суспензию содержащую анализируемые клетки смешивают с меченными антителами и флуоресцентными ферментами. Затем создается направленный поток жидкости, параметры которого подобраны так, чтобы клетки выстроились в один ряд. Это достигается двумя путями: 

  • Акустическое фокусирование. Клетки выстраиваются в определенном порядке под воздействием специально подобранных звуковых волн; 
  • Гидродинамическое фокусирование. Тот же результат получают путем изменений параметров движения суспензии, содержащей исследуемые клетки. 

После фокусировки клетки поступают в проточную ячейку, в которой их облучают при помощи лазера. Ответные световые сигналы регистрируются чувствительным фотоэлементом и преобразуются в цифровой сигнал. В дальнейшем его анализируют путем обработки в специальном программном обеспечении. 

Хемилюминесценция 

Метод диагностики в иммунологии который осуществляется за счет анализа свечения биологической пробы. Суть его состоит в регистрации светового излучения, возникающего в момент реакции антиген/антитело. Любая такая реакция сопровождается свечением, но интенсивность его крайне мала. 

Для усиления светового потока используют особые вещества – люминофоры. Если в их присутствии происходит иммунная реакция, происходит возбуждение определенных частей молекулы люминофора, затем их стабилизация. При этом «лишняя» энергия выделяется в виде фотонов. Чем больше антител прореагировало – тем сильнее будет поток сгенерированного люминофором света. 

Существуют и другой тип индикаторов, используемых в хемилюминесценции. Они сами не светятся, но усиливают природное свечение иммунных реакций. Чаще всего в качестве такого усилителя используют соединения кумарина, они способны усиливать естественную хемилюминесценцию в тысячи раз. 

Хемилюминесценцию используют для изучения процессов фагоцитоза, нюансов работы защитных систем клеток. В медицине методику применяют для получения данных о воспалительных реакциях и наследственных заболеваниях. 

  

Источник: https://ukrepit-immunitet.ru/immunitet/sovremennye-metody-immunologii/

Медик
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: