Методы изучения генетического материала пцр гибридизация блоттинг

Гибридизация ДНК: понятие, определение, этапы развития и применение

Методы изучения генетического материала пцр гибридизация блоттинг

Что лежит в основе гибридизации ДНК? Хотя двухцепочечная ДНК -последовательность в целом стабильная в физиологических условиях, изменение этих условий в лаборатории (как правило, путем повышения температуры окружающей среды) приведет к тому, что молекулы будут разделены на отдельные нити. Последние являются взаимодополняющими друг к другу, но могут также дополнять другие последовательности, присутствующие в их окружении. Опускание окружающей температуры позволяет однонитевым молекулам отжигать или «гибридизоваться» друг с другом. Это и есть метод гибридизации ДНК.

Понятие с точки зрения молекулярной биологии

Ученые, занимающиеся как репликацией ДНК, так и транскрипцией ДНК в РНК, полагаются на скрещивание нуклеотидов между собой и методы молекулярной биологии. Сюда включаются Саузерн-блоты и Нозерн-блоты, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и большинство подходов к секвенированию и гибридизации ДНК-РНК.

Применение

Гибридизация является основным свойством нуклеотидных последовательностей и используется в многочисленных методах молекулярной биологии. Общая генетическая взаимосвязь двух видов может быть определена путем гибридизации сегментов их ДНК (ДНК-ДНК-гибридизация).

Из-за сходства последовательностей между близкородственными организмами требуется более высокая температура для таяния таких гибридов ДНК по сравнению с более удаленными организмами.

Различные методы используют гибридизацию для определения происхождения образца ДНК, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР). В другом методе короткие последовательности ДНК гибридизуются с клеточной мРНК для идентификации экспрессируемых генов.

[attention type=yellow]

Фармацевтические компании изучают использование антисмысловой РНК для связывания с нежелательной мРНК, предотвращая рибосому от перевода мРНК в белок.

[/attention]

ДНК-ДНК-гибридизация обычно относится к методу молекулярной биологии, который измеряет степень генетического сходства между пулами последовательностей ДНК. Он обычно используется для определения генетического расстояния между двумя организмами. Это широко использовалось в филогении и таксономии.

Методология

ДНК одного организма метили, затем смешивали с не меченной ДНК, которую можно было сравнить с ней. Смесь инкубируют, чтобы позволить цепям ДНК диссоциировать и затем охлаждаться с образованием возобновленной гибридной двухцепочечной ДНК.

Гибридизированные последовательности с высокой степенью сходства будут более жестко связываться и требуют больше энергии для их разделения: т. е.

они разделяются при нагревании при более высокой температуре, чем разнородные последовательности, процесс, известный как «плавление ДНК».

Плавление ДНК

Оценивая профиль плавления гибридизованной ДНК, двухцепочечную ДНК связывают с так называемой «колонкой», а получившуюся смесь нагревают. На каждом этапе колонку промывают, а последовательности ДНК, которые плавятся, становятся одноцепочечными и смывают колонну.

Температуры, при которых помеченная ДНК выходит из колонки, отражает количество сходства между последовательностями (и образец самосгибания служит в качестве контроля). Эти результаты объединены, чтобы определить степень генетического сходства между организмами.

Как утверждает современная микробиология, гибридизация ДНК невозможно без понимания этих вещей.

Когда несколько видов рибонуклеиновой (или дизоксирибонуклеиновой) кислоты сравниваются таким образом, значения сходства позволяют размещать виды в филогенетическом дереве.

Следовательно, это один из возможных подходов к проведению молекулярной систематики.

Чарльз Сибли и Джон Альквист, пионеры этой техники, использовали ДНК-ДНК-гибридизацию для изучения филогенетических отношений птиц (систематика Сибли-Алквиста) и приматов.

Значение для биологии

ДНК-ДНК-гибридизация является золотым стандартом для различения бактериальных видов с величиной сходства более 70%, что указывает на то, что сравниваемые штаммы относятся к разным видам. В 2014 году был предложен порог 79% сходства для разделения бактериального подвида.

Критики утверждают, что техника неточна для сравнения близких видов, так как любая попытка измерить различия между ортологическими последовательностями между организмами перегружена гибридизацией паралоговых аналогов в геноме организма.

Секвенирование ДНК и вычислительные сравнения последовательностей в настоящее время обычно являются методом определения генетического расстояния, хотя этот подход все еще используется в микробиологии, чтобы помочь идентифицировать бактерии.

Современный способ заключается в проведении гибридизации ДНК-ДНК в силиконе с использованием полностью или частично секвенированных геномов.

[attention type=red]

GGDC, разработанный в DSMZ, является наиболее точным известным инструментом для вычисления DDH-аналогичных значений.

[/attention]

Среди других алгоритмических улучшений он решает проблему с паралогическими последовательностями, тщательно фильтруя их из совпадений между двумя последовательностями генома.

Метод FISH

Флуоресцентная гибридизация молекул ДНК (Fluorescence In Situ Hybridization — FISH) представляет собой лабораторный метод, используемый для обнаружения и определения последовательности ДНК, часто на определенной хромосоме.

В 1969 году Джозеф Галл и Мэри Лу Парду опубликовали документ, демонстрирующий, что радиоактивные копии последовательности рибосомной ДНК могут быть использованы для обнаружения комплементарных последовательностей ДНК в ядре лягушечьего яйца.

Начиная с этих оригинальных наблюдений, многие уточнения повысили универсальность и чувствительность процедуры до такой степени, что гибридизация in situ («на своем месте», латынь) в настоящее время считается важным инструментом в цитогенетике.

(Термином in situ в настоящее время также обозначают начальную стадию роста карциномы, когда в патологический процесс вовлечена лишь эпителиальная ткань.)

Последовательность флуоресцентной гибридизации

РНК-зонды могут быть сконструированы для любого гена или любой последовательности внутри гена для визуализации мРНК lncRNA и miRNA в тканях и клетках.

FISH используется путем изучения цикла клеточного размножения, в частности интерфазы ядер для любых хромосомных аномалий.

FISH позволяет анализировать большую серию архивных случаев, намного легче идентифицировать выявленную хромосому, создавая зонд с искусственным хромосомным основанием, который будет привлекать подобные хромосомы.

Сигналы гибридизации для каждого зонда, когда обнаруживается аномалия ядра: каждый зонд для обнаружения мРНК и lncRNA состоит из 20 пар олигонуклеотидов, каждая пара покрывает пространство 40-50 б. п. Для обнаружения мРНК зонды используют запатентованную химию.

Гибридизация с ДНК-зондами

Зонды часто получают из фрагментов ДНК, которые были выделены, очищены и амплифицированы для использования в проектировании генома человека. Размер человеческого генома настолько велик по сравнению с длиной, которая может быть секвенирована напрямую, что необходимо разделить его на фрагменты.

В конечном счете эти фрагменты приводились в порядок путем переваривания копии каждого фрагмента в еще более мелкие элементы с использованием эндонуклеаза, специфичных для последовательностей, для измерения размера каждого небольшого фрагмента с использованием эксклюзионной хроматографии с использованием этой информации для определения, где большие части перекрывались друг с другом.

Чтобы сохранить элементы с их индивидуальными последовательностями ДНК, фрагменты были добавлены в систему постоянно повторяющихся популяций бактерий. Клональные популяции бактерий, каждая популяция, поддерживающая единую искусственную хромосому, хранятся в различных лабораториях по всему миру.

[attention type=green]

Искусственные хромосомы (BAC) можно выращивать, извлекать и помечать в любой лаборатории, содержащей библиотеку. Геномные библиотеки часто называются в честь учреждений, в которых они были разработаны. Примером может служить библиотека RPCI-11, названная в честь Института рака Розуэлла в Буффало (Нью-Йорк, США).

[/attention]

Эти фрагменты составляют порядка 100 тысяч базовых пар и являются основой большинства зондов FISH.

Источник: https://News4Auto.ru/gibridizaciia-dnk-poniatie-opredelenie-etapy-razvitiia-i-primenenie/

Методы изучения генетического материала пцр гибридизация блоттинг

Методы изучения генетического материала пцр гибридизация блоттинг

В методе секвенирования с использованием меченных флуоресцентной меткой или радиоактивным изотопомдидезоксинуклеотидов ПЦР является неотъемлемой частью, так как именно в ходе полимеризации в цепь ДНК встраиваются производные нуклеотидов, меченные флуоресцентной или радиоактивной меткой. Присоединение дидезоксинуклеотида к синтезируемой цепи приводит к обрыву синтеза, позволяя определить положение специфических нуклеотидов после разделения в геле.

Мутагенез

В настоящее время ПЦР стала основным методом проведения мутагенеза (внесения изменений в нуклеотидную последовательность ДНК). Использование ПЦР позволило упростить и ускорить процедуру проведения мутагенеза, а также сделать её более надёжной и воспроизводимой.

197. Этапы пцр

1 этап (денатурация). Нагревание ДНК до 95 С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.

2 этап (отжиг). Гибридизация праймеров при 55-60 С с комплементарными последовательностями на противоположных цепях ДНК (на левой и правой границах амплифицируемого фрагмента).

Генспецифические праймеры создают при помощи компьютерных программ, использующих информацию о нуклеотидной последовательности известных генов микроорганизмов или генов человека, предоставленных на сайтах GenBank и EMBL

3 этап (элонгация). При температуре 68-72 С праймеры в присутствии ДНК-полимеразы и дезоксирибонуклеотидтрифосфатов служат затравками для синтеза комплементарной цепи на ДНК-матрице, начинающейся от места гибридизации праймера и происходящей в направлении 5’-3’.

В последующих циклах вновь синтезируемые молекулы ДНК становятся, в свою очередь, матрицей для аналогичного синтеза новых копий. Поскольку синтез каждой из двух антипараллельных цепей ДНК начинается от места гибридизации праймера, эти места и становятся границами синтезируемого участка.

По сути, метод ПЦР как бы «имитирует» на ограниченном участке гена естественный процесс репликации ДНК, происходящей in vito.

198.Метод fish и его применение в медицине.(см вопрос 201)

Флуоресце́нтная гибридиза́цияin situ, или метод FISH (англ.

 fluorescence in situ hybridization FISH), — цитогенетический метод, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательностиДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ.

Кроме того, FISH используют для выявления специфических мРНК в образце ткани. В последнем случае метод FISH позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в клетках и тканях.

Метод FISH используют в преимплантационной, пренатальной и постнатальной генетической диагностике, в диагностике онкологических заболеваний[2], в ретроспективной биологической дозиметрии.

Для женщин старшего репродуктивного возраста беременность может оказаться поводом не столько для радости, сколько для беспокойства. С возрастом женщины связан риск развития хромосомных аномалий плода. Амниоцентез, осуществляемый на 16-й неделе беременности, с последующим анализом кариотипа занимает 10-14 дней.

Использование FISH в предварительном обследовании позволяет ускорить диагностику и уменьшить время ожидания. Большинство генетиков и лабораторий придерживаются мнения, что метод FISH не следует использовать изолированно для принятия решения о дальнейшем ведении беременности.

[attention type=yellow]

Метод FISH обязательно следует дополнять кариотипическим анализом, и его результаты как минимум должны коррелировать с патологической картиной ультразвукового исследования (УЗИ) или биохимического скрининга по крови матери. Синдромы генных последовательностей известны также под названием синдромов микроделеции, или сегментарной анеусомии.

[/attention]

Это делеции смежных фрагментов хромосомы, вовлекающие, как правило, многие гены. Синдромы генных последовательностей были впервые описаны в 1986 г. с использованием классических методик цитогенетики.

Теперь, благодаря FISH, возможна идентификация субмикроскопических делеции на уровне ДНК, что позволило выявлять наименьший делецированный регион, связанный с развитием того или иного синдрома, получивший название критического региона.

После определения критического региона для синдрома зачастую становится возможным идентифицировать специфические гены, отсутствие которых признают ассоциированным с этим синдромом. В недавно вышедшем руководстве по синдромам генных последовательностей сообщают о 18 синдромах делеции и микроделеции, ассоциированных с 14 хромосомами.

Источник: studfile.net

Источник: https://naturalpeople.ru/metody-izuchenija-geneticheskogo-materiala-pcr-gibridizacija-blotting/

Применение метода полимеразной цепной реакции

Методы изучения генетического материала пцр гибридизация блоттинг
Перейти к содержимому

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) резко трансформировала научную и диагностическую медицину. На протяжении многих лет ПЦР стала неотъемлемой частью клинических и диагностических исследований.

Метод ПЦР и его несколько продвинутых вариантов выступают в качестве мощных инструментов, которые позволяют использовать множество специализированных приложений, которые когда-то считались невозможными для научного мира.

Применение ПЦР в различных научных дисциплинах

Ниже приводятся некоторые из ключевых применений ПЦР в области генетических исследований, медицины, судебной медицины и экологической микробиологии.

Генетические исследования

ПЦР произвела революцию в научных исследованиях с тех пор, как в 80-х годах она впервые была представлена ​​научному миру. В области генетических исследований она используется для:

  • Быстрое увеличение количества небольших фрагментов ДНК с использованием ПЦР позволило использовать несколько гибридизацию для саузерн- и нозерн-блоттинга даже если количество материала для анализа очень мало.
  • Изучение моделей экспрессии генов является еще одним распространенным применением ПЦР, когда клетки или ткани анализируются на разных стадиях, чтобы проверить экспрессию определенного гена. qPCR может использоваться здесь для количественного определения уровня экспрессии генов.
  • ПЦР также помогает в таких методах, как секвенирование ДНК, с помощью которых сегменты ДНК из интересующей области могут быть легко усилены для изучения генетических мутаций и их последствий.
  • Проект генома человека использовал ПЦР для указания наличия определенного сегмента генома в конкретном клоне. Это позволило отобразить клоны и собрать результаты из нескольких лабораторий.
  • Было найдено, что усовершенствованные варианты метода ПЦР полезны в методах хромосомного анализа, которые могут помочь в раннем выявлении генетических врожденных дефектов у детей.
  • ПЦР дополняет традиционный метод клонирования ДНК путем амплификации крошечных сегментов ДНК для введения в вектор. Изменяя протокол ПЦР, сайт-направленные или общие мутации могут быть достигнуты в интересующем фрагменте ДНК.

Медицина

ПЦР затронуло множество разработок в некоторых медицинских дисциплинах, таких как:

Микробиология

ПЦР является очень ценным методом в микробиологии, так как позволяет проводить обнаружение важных микроорганизмов. Например Mycobacterium tuberculosis, могут быть эффективно изучены с помощью генотипирования. Это позволяет производить раннее выявление и лечение и значительно влияет на мониторинг общественного здравоохранения.

Вирусология

В вирусологии ПЦР помогала выявлять и характеризовать нуклеиновые кислоты вирусов, что позволило обеспечить всестороннюю их характеристику и большее понимание поведения вируса во время инфекции.

Это понимание очень помогло клиническому лечению и расширило дальнейшие исследования вирусов. Например, ПЦР используется для выявления ВИЧ-инфекции на ранней стадии еще до образования антител.

Также она используется для скрининга образцов крови, собранных в донорских центрах.

Микология и паразитология

Технология ПЦР также нашла применение в микологии и паразитологии, позволив производить раннее выявление микроорганизмов, помогая тем самым эффективной диагностике и лечению грибковых и паразитарных инфекций.

Стоматология

Метод ПЦР стал стандартным диагностическим и исследовательским инструментом в области стоматологии. ПЦР и другие методы молекулярной биологии позволяют диагностировать инфекционные заболевания, вызывающие челюстно-лицевые инфекции. Это помогает в эффективной борьбе с такими болезнями, как периодонтальная болезнь, кариес, рак полости рта и эндодонтические инфекции.

Криминалистика

С появлением фингерпринтинга ДНК на основе ПЦР последняя стала бесценным инструментом в судебных расследованиях.

  • Используя «отпечатки пальцев» ДНК, крошечные фрагменты ДНК можно выделить на месте преступления и сравнить с огромной базой данных ДНК осужденных или преступников. Также этот метод используется и для исключения подозреваемых в ходе расследования.
  • Фиксация ДНК также используется при установлении отцовства, где ДНК от человека совпадает с ДНК его возможных детей, братьев и сестер или родителей.

Экологическая микробиология

Метод ПЦР был успешно использован для изучения многих проблем микробиологии окружающей среды. Ниже перечислены некоторые из его экологических приложений:

  • Чувствительное обнаружение деградирующих микроорганизмов в токсичных отходах и загрязняющих веществах может быть проведено с помощью ПЦР, что способствует повышению эффективности биодеградации и биоремедиации на загрязненных участках.
  • Обнаружение индикаторных бактерий, таких как колиформы в водоснабжении, позволяет повысить безопасность воды.
  • ПЦР также используется для обнаружения и мониторинга микробиологических патогенов, передающихся через воду, которые представляют собой серьезную угрозу для здоровья населения.

Источник: https://LabwareGuid.ru/2017/12/19/use-pcr-method/

Медик
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: